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热休克蛋白27在人胸主动脉夹层的表达研究

来源:华世论文网
 

                         作者:廖明芳 崔佳森 张健 王亮 刘延玲 包俊敏 景在平

【摘要】    目的:探讨热休克蛋白(heat shock protein, HSP)27在胸主动脉夹层(thoracic aortic dissection,TAD)中的表达情况,并初步了解其在TAD中的可能作用。方法:组织化学染色检测TAD病理特征,免疫组织化学染色检测HSP27在动脉壁中的表达和定位, Western Blot验证其表达,并分析HSP27表达与TAD患者临床病理参数如直径、高血压和炎症反应等的关系。结果:Western blot和免疫组化染色均显示HSP27在两组标本中均有表达,TAD组表达较正常组减低。HSP27蛋白主要位于中膜和外膜小血管和炎性细胞的胞质。相邻切片α肌动蛋白表达分布与HSP27基本一致。HSP27表达与其直径、患者高血压、急慢性病程和年龄等参数无明显相关性,这可能与例数较少有关。结论:HSP27蛋白在TAD中表达减少,中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)是其主要细胞来源;HSP27可能通过调节肌动蛋白和SMC的功能等机制在TAD发挥作用,需进一步研究证实。

【关键词】  胸主动脉夹层?热休克蛋白?血管平滑肌细胞

   Expression of heat shock protein 27 in human thoracic aortic dissection

       【ABSTRACT】 Objective: To find HSP27 potein expression changed in thoracic aortic dissection (TAD) compared with normal control by differential proteomics approach. This study was performed to investigate the expression and localization of HSP27 and its possible roles in TAD. Methods: Histology and immunohistochemistry were performed to detect the expression and localization of HSP27 protein in dissected thoracic aortas and normal controls. Western Blot was used to invalidate its expression. Then the correlation between HSP27 expression and some clinical parameters such as diameter and hypertension were analyzed. Results: Western blot and immunohistochemistry showed that HSP27 expression decreased in TAD compared with normal controls. HSP27 protein mainly localized in the media. Contiguous slices of TAD showed similar expression and distribution between alpha actin and HSP27. There was no significant correlation between HSP27 protein expression and clinical parameters including ages, diameters, hypertension and inflammation, which might be related to the small sample size. Conclusions: HSP27 protein expression decreased in TAD and SMC was the main cellular resource. HSP27 may play important role in TAD through some mechanisms such as regulating SMC and actin function, which need further research.

    【KEY WORDS】 Thoracic aortic dissection?Heat shock proteins?Vascular smooth muscle cells

      主动脉夹层(aortic dissection, AD)是累及主动脉最灾难性的疾病,主要发生在胸主动脉,称胸主动脉夹层(thoracic aortic dissection, TAD)。近年TAD的发病率呈上升趋势,发病年龄趋向年轻化,TAD一旦破裂死亡率极高,是严重危害中老年患者生命的主要心血管疾病之一[1]。随着腔内血管外科理论和技术的发展,TAD的治疗已经取得了较大的进展,部分TAD患者已从传统的开放性开胸人工血管置换术转向微创的腔内隔绝术[2],降低了病死率及各种手术并发症率。尽管这些方法能较有效的治疗TAD,仍有许多患者在明确诊断前或得到手术治疗之前已经破裂死亡,尤其是急性主动脉夹层破裂,是猝死的重要原因之一[1,3]。因而,从发病机制水平进行TAD的预防、诊断和治疗的研究具有非常重要的意义,而目前对TAD发病机制的认识仍处于初步阶段。本研究前期研究应用差异蛋白质组学方法对TAD夹层撕开动脉和正常人胸主动脉壁中膜的蛋白质组进行比较分析,发现两组动脉壁组织中的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)27表达存在差异。本研究在差异蛋白质组学研究的基础上进一步验证HSP27在TAD中的表达与定位,并初步分析其在TAD中的可能作用。

    1 材料与方法

    1.1 标本采集 实验标本为 TAD 患者的夹层撕开动脉壁(dissected aorta, DA)和正常人胸主动脉壁(normal aorta, NA)。收集我院 2003~2005 年行人工血管置换术的TAD患者 6 例,获取新鲜胸主动脉夹层标本。患者均为男性,中位年龄48.1岁,均诊断为急性DebakeyⅠ型夹层,MRA或CTA显示升主动脉平均最大直径为(5.62±1.3)cm,其中合并高血压者 5 例(83.3%),无马凡综合征等先天性疾病。大体标本观察动脉环明显扩张,约 1/2~2/3 的动脉环可见夹层撕裂,假腔内可见血栓,其中 5 例标本的内壁可见程度不等的米黄色粥样硬化斑块。从器官移植供者中获取正常新鲜升主动脉 6 例,均为男性,平均年龄(39.5±7.2)岁,动脉平均直径(2.48±0.3) cm,均无主动脉夹层和动脉瘤等血管疾病史。大体观察动脉环呈圆形,弹性较好,动脉壁完整,其中有2例可见轻中度的粥样硬化斑块。

      人TAD动脉壁石蜡包埋标本15例(包括上述6例异常标本,其余9例来源于主动脉切除人工血管置换术的TAD患者),男13例,女2例,中位年龄45.5岁。正常对照为正常人胸主动脉石蜡标本10例(包括上述6例正常标本,其余4例来源于尸检和器官捐献者),男8例,女2例,中位年龄38.3岁,除上述2例外均无主动脉疾病。

    1.2 标本处理 获取新鲜标本后,用预冷的生理盐水冲洗数遍,洗净附在血管壁上的血液和附壁血栓,按实验分组剪取所需标本浸入4%甲醛保存,其余标本分装后做好标记立即置于液氮中保存备用。

    1.3 苏木精-伊红染色(HE 染色)和维多利亚兰染色(VB 染色)4% 甲醛固定、脱水、组织浸蜡、包埋,连续切片 5 μm 厚。染色按常规操作进行。

    1.4 免疫组织化学染色 对同一标本的相邻切片分别进行各指标的免疫组化染色(室温下完成),采用二步法免疫组织化学检测试剂盒(GBI, USA),基本流程按常规操作。一抗为抗人HSP27单克隆抗体和兔抗人α肌动蛋白抗体,按1∶100稀释,DAB显色。实验对照设立:1)空白对照:用PBS代替一抗作阴性对照,结果为阴性。2)替代对照:用正常未免疫血清代替一抗作阴性对照,结果为阴性。3)用已阳性组织作阳性对照,结果为阳性。应用Leica显微镜及Qwin 550图像采集卡进行图像采集,镜下阳性蛋白为黄色、棕黄色或棕色颗粒样沉淀。按以下标准进行判断统计,在400倍显微镜下随机取10个视野,计算阳性蛋白百分比(阳性细胞数占细胞总数的百分比),然后进行综合评分(由两人分别进行判断统计)。两分相加:0 分为阴性(-),2~3 分为弱阳性(+),4~5 分为中度阳性(++),6~7 分为强阳性(+++)。α-SMA 染色及结果和炎症反应程度的判断同 HSP27。

    1.5 Western 印迹法 每个样品等量上样于12%聚丙烯酰胺凝胶中,进行电泳,然后转膜、抗体结合及染色。按常规操作进行。

    1.6 统计学分析 用SPSS10.0软件进行分析,HSP27 的染色强度与病例的临床参数如直径、年龄和高血压等参数应用 Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)χ2 进行统计学分析。

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