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Bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的作用

来源:华世论文网
 

【摘要】    目的:探讨Bcl-2基因对阻塞性黄疸大鼠肝细胞损害中细胞凋亡的调控作用。方法:采用胶原酶原位肝灌注法获取对照组大鼠肝细胞及阻塞性黄疸实验组术后3、7、14、21 d大鼠的肝细胞,分别用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA的表达。分离对照组及实验组14 d组大鼠的肝细胞行原代培养后,使用100 μmol/L甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)作用于两组肝细胞24 h后,用FCM法测定肝细胞的凋亡比率,用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测。结果:(1)对照组大鼠肝细胞无Bcl-2 mRNA表达,实验组术后7、14、21 d组大鼠肝细胞均有Bcl-2 mRNA表达;(2)GCDC作用两组大鼠肝细胞后,实验组比对照组肝细胞凋亡明显减少(P< 0.001)。结论:在阻塞性黄疸过程中,大鼠肝细胞通过表达Bcl-2基因是抑制胆盐致肝细胞的凋亡作用的途径之一。

【关键词】  凋亡 黄疸 阻塞性  基因 Bcl-2 大鼠 Wistar

  Role of Bcl-2 gene in apoptosis of hepatocytes in rats with obstructive jaundice

       【ABSTRACT】 Objective: To explore the regulating mechanism of Bcl-2 gene in hepatocyte injury caused by obstructive jaundice in rats by comparing apoptotic rate. Methods: Normal rats’ and bile duct-ligated 7 d, 14 d, 21 d rats’ hepatocytes were isolated by in situ collagenase perfusion and primary culture. (1)Bcl-2 mRNA was detected by RT-PCR in all cells; (2)After normal rat and bile duct-ligated 14d rat hepatocytes were added 100 μmol/L GCDC and kept for 24 hours, cells were evaluated by FCM and TUNEL. Results:(1)Normal rat hepatocytes did not express Bcl-2 by RT-PCR technique. Bcl-2 was expressed in 7-,14-,21- day BDL rats.(2)After adding 100 μmol/L GCDC and keeping for 24 hours, the apoptosis of bile duct-ligated rat hepatocytes significantly decreased compared with that of normal rat hepatocytes. Conclusions: Bile duct-ligated rat hepatocytes expressed Bcl-2.Hepatocellular expression of Bcl-2 during obstructive jaundice is an adaptive phenomenon to resist apoptosis by bile salts.

    【KEY WORDS】 Hepatocyte apoptosis?Jaundice, obstructive ?Genes, Bcl-2?Rat, Wastar

      阻塞性黄疸因胆汁淤积引起胆盐升高,造成肝损害。本研究通过观察正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠体外培养肝细胞Bcl-2 mRNA的表达情况,研究其与细胞凋亡的关系,探讨胆盐致肝细胞损害的调控机制。  

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠50只,随机分为5组,每组10只,其中4组为实验组,1组为对照组。全部实验组大鼠均手术游离出胆总管,于肝门部结扎胆总管并切断,远端再予结扎。分别于结扎3 、7 、14 和21 d后处死1组。对照组手术不结扎切断胆总管,14 d处死。

    1.2 大鼠肝细胞的分离与培养 采用胶原酶原位肝灌注法[1]获取肝细胞,4%台盼蓝染色判断肝细胞存活率,细胞计数板记数细胞浓度。细胞于合成培养基(RPMI 1640 80 ml,新生小牛血清20 ml,青霉素100 U/ml,链霉素100 μg/ml,胰岛素0.1 U/ml,hepes 15 mmol)培养36 h。培养条件37 ℃,5% CO2。冷冻保存。

    1.3 主要试剂 甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)、碘化丙锭(PI)染色剂为Sigma公司产品。TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司提供。Trizol一步法总RNA提取试剂盒和Tag酶由Promega公司提供。Bcl-2引物及β-actin特异性寡核苷酸引物由中科院上海细胞生物研究所合成。Bcl-2的引物序列为Forward Primer:5’ ̄GT ̄CAT ̄AAC ̄TAA ̄AGA ̄CAC ̄CCC ̄3’,Reverse Primer:5’ ̄TTC ̄ATC ̄TCC ̄AGT ̄ATC ̄CCA ̄CTC ̄3’;β-actin的引物序列为Forward Primer: 5’ ̄TAG ̄AAG ̄CAT ̄TTG ̄CGG ̄TGC ̄ACG ̄3’,Reverse Primer: 5’ ̄TCC ̄TG ̄CAG ̄CAA ̄TGC ̄CTG ̄GGT ̄3’[2,3]。

    1.4 检测指标

    1.4.1 大鼠血清胆红素的测定 对照组和结扎3、7 、14 和21 d组抽血,所有大鼠经门静脉抽血,离心后取上层血清行胆红素测定。

    1.4.2 大鼠肝细胞Bcl-2 mRNA表达的检测 分别收集各组大鼠肝细胞1×106 ml-1,用Trizol试剂盒一步法提取肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增Bcl-2和对照β-actin基因片段。反应总体积为50 μl,反应条件为94 ℃,5 min→94 ℃,45 s→57 ℃,45 s→72 ℃,1 min,共40个循环,72 ℃最后延伸。每组扩增产物各取10 μl,2%琼脂糖凝胶电泳。拍照后,对Bcl-2及β-actin条带行光密度扫描。以Bcl-2条带与β-actin条带光密度之比作半定量,进行t检验分析,P≤0.05为差异有统计学意义。

    1.4.3 大鼠凋亡肝细胞的检测 将对照组及结扎14 d组大鼠的肝细胞按1×106ml-1,1 ml/孔,分别种于内含小飞片的24孔培养板中,培养36 h。加入终浓度为100 μmol/L的GCDC,培养24 h后取出小飞片,行TUNEL检测。同时0.25%胰酶消化培养孔内细胞,行FCM检测。

    1.5 统计学处理 应用SAS 8.2版统计软件包行多元方差分析和t检验,P≤0.05为差异有统计学意义。

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