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核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用

来源:华世论文网
 

【摘要】  目的 研究大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中,肝脏核转录因子KLF6及相关基因表达变化及其作用。方法 建立高脂饮食脂肪性肝纤维化模型,用RT?PCR与免疫组织化学法观察肝组织中KLF6、TGF?β1、α?SMA表达变化,放射免疫法检测血清肝纤维化指标HA、LN、CⅣ。结果 模型组大鼠高脂喂养8周呈现单纯性脂肪变,肝脏KLF6、TGF?β1、α?SMA的mRNA表达与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。12周时随着脂肪变的加重,KLF6 mRNA表达上调(0.62±0.10,P<0.01),于16周达高峰(1.01±0.07,P<0.01),24周略有回落(0.81±0.08,P<0.01);而TGF?β1和α?SMA的mRNA表达于16周时开始增高(0.62±0.19、0.77±0.12,P<0.01),24周达高峰(0.91±0.07、1.08±0.19,P<0.01)。相关分析发现,KLF6与TGF?β1、α?SMA表达以及肝纤维化分级评分之间呈显著正相关(r=0.848、0.859、0.706,P<0.01)。结论 高脂饮食引起KLF6表达增强,最初可能是一种适应性反应,随着其表达进一步增强,可引起TGF?β1和α?SMA表达持续上调,从而促进脂肪性肝纤维化的发生、发展。

【关键词】  KLF6 转化生长因子β1 平滑肌肌动蛋白 非酒精性脂肪性肝病 肝纤维化

    【Abstract】  Objective  To study the expression and significance of Kruppel?like factor 6 (KLF6) and relative genes during the course of development of nonalcoholic fatty liver fibrosis in rats. Methods  A rat fatty liver fibrosis model was established by a high fat feeding to observe expression changes of KLF6, transforming growth factor β1 (TGF?β1) and α?SMA by immunohistochemistry and RT?PCR. In the meantime, HA, LN and CIV were detected by means of radio?immunity. Results  At the 8th week in high fat feeding group, there was found fatty livers, with insignificant difference in aspects of expressions of KLF6, TGF?β1 and α?SMA mRNA compared with control group (P<0.05). Expression of KLF6 mRNA was up?regulated to (0.62±0.10, P<0.01) with appearance of fatty hepatitis at the 12th week, reached peak at (1.01±0.07) at the 16th week (P<0.01) and decreased slightly to (0.81±0.08) at the 24th week (P<0.01). Whereas, expressions of TGF?β1 and α?SMA mRNA began to up?regulate to (0.62±0.19, 0.77±0.12) at the 16th week (P<0.01) and reached peak at (0.91±0.07, 1.08±0.19) at the 24th week (P<0.01). KLF6 was closely correlated with expressions of TGF?β1 and α?SMA and with scoring of hepatic fibrosis (r=0.848, 0.859, 0.706,P<0.01). Conclusion  The high expression of KLF6 at the early stage induced by high fat feeding is an adaptive reaction of the body and, with the advanced expression of withKLF6, can lead to continuous expression up?regulation of TGF?β1 and α?SMA and hence promote development of fatty fibrosis.

    【Key words】  Kruppel?like factor 6; Transforming growth factor β1; α?smooth mucle actin; Nonalcoholic fatty liver disease; Liver fibrosis

    肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤疾病的一种修复应答反应,具有可逆性。细胞因子网络调控的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化形成的主要发病机制。体内外实验证明在HSC的活化过程中相关细胞/生长因子的转录均受相应的核转录因子的调控。已知在肝纤维化发生过程中转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF?β1)是最主要的促纤维生成因子,可使肝星状细胞激活并分泌大量胶原纤维。目前有关TGF?β1及其下游信号通路的研究较多,而对其上游调控基因在纤维化形成中的表达研究较少。研究发现核转录因子KLF6(kruppel?like factor 6)是一种损伤后修复基因,对TGF?β1及其受体具有反式激活作用[1],很可能是调节HSC激活过程中TGF?β1自分泌环的重要因子。因此本实验通过观察TGF?β1及其上游调节基因KLF6在脂肪性肝纤维化形成中的动态变化,初步探讨KLF6在脂肪性肝纤维化形成中的作用和机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    胆固醇和胆盐购自重庆市医药公司生化试剂公司; 透明质酸(HA)、 层黏连蛋白(LN)、 Ⅳ型胶原(CⅣ)放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所;Tripure购自上海罗氏公司;RT?PCR试剂盒购自大连宝生物公司;PCR Marker购自Takara公司;焦磷酸二乙酯(DEPC)购自Sigma公司;KLF6兔多克隆抗体购自Satan公司;平滑肌肌动蛋白(α?smooth mucle actin,α?SMA)小鼠单克隆抗体购自武汉博士德。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型[2]    雄性Wistar大鼠40只购自第三军医大学大坪医院实验动物中心,体重180~200 g。正常喂养1周后,随机分为2组。对照组(C组)8只以普通饲料喂养,16周处死。模型组(F组)32只以2%胆固醇+15%猪油+0.5%胆盐+82.5%普通饲料构成高脂饲料喂养,建立实验性脂肪性肝纤维化动物模型。分别于8、12、16、24周以速眠新1 ml/kg麻醉大鼠,腹主动脉采血,肝右叶中部切取2块肝组织,1块为1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小,用4%聚甲醛固定制备石蜡切片,另1块为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小,置于-70 ℃冰箱储存, 用于RT?PCR检测。

    1.2.2  血清学指标    血清TG、FFA、ALT、AST采用全自动生化分析仪检测。放射免疫法检测血清HA、LN、CⅣ,严格按试剂盒说明书进行操作。

    1.2.3  组织病理学    4%聚甲醛固定肝组织,石蜡包埋,常规苏木精?伊红(HE)染色,病理分级分期参照文献[3];Masson染色观察有无肝纤维化并分级,依据纤维化的范围和程度将脂肪性肝纤维化分为5级,S0:无纤维化;S1:腺泡带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化;S2:纤维化扩展到门管区星芒状纤维化;S3:纤维化扩展到门管区周围,局灶性或广泛的的桥接纤维化;S4:肝硬化。肝纤维化分级评分标准:S0 0分;S1 1分;S2 2分;S3 3分;S4 4分。

    1.2.4  免疫组化    肝组织石蜡切片常规脱蜡至水,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,PBS洗3次,pH8.0 EDTA微波修复,滴加不同稀释浓度的一抗(KLF6 1∶200,α?SMA 1∶50)后4 ℃过夜,次日滴加二抗,37 ℃孵育1 h后DAB显色,经苏木素复染,稀盐酸酒精分色后封片观察,每次实验均设阴性对照,以磷酸盐缓冲液代替一抗。每例均随机观察5个高倍视野,读取阳性细胞数。

    王晓敏,等. 核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用  1.2.5  KLF6、TGF?β1、α?SMA mRNA检测    肝组织总RNA的提取,按Tripure试剂盒说明进行操作,最后加入DEPC去离子水20 μl重新溶解RAN,待用。RNA样品的纯度根据260 nm及280 nm吸光值的比值(A260/280)来计算,比值在1.6~2.0之间。RNA样品的电泳鉴定:取用1%甲醛变性琼脂糖凝胶,10 μg RAN样品电泳,紫外观察,如28 S、18 S、5 S rRAN带清晰可见,带与带之间无明显脱尾则表明RAN无明显降解,可用于RT?PCR分析。

    1.2.6  引物设计    利用引物设计软件设计各引物。KLF6上游引物为5'?TGCCTGGAGTTGGAACGCTATC?3',下游引物为5'?TGCTTTCGGAAGTGTCTGGTC?3',扩增片段656 bp;TGF?β1上游引物为5'?ACCGCAACAACGCAATCTATG?3',下游引物为5'?ATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC?3',扩增片段298 bp;α?SMA上游引物为5'?AGGGACTAATGGTTGGAATGG?3',下游引物为5'?CAATCTCACGCTCGGCAGTAG?3',扩增片段504 bp;内参照β?actin上游引物为5'?GCTGTGCTATGTTGCCCTAGACT?3',下游引物为5'?CGGACTCATCGTACTCCTGCTTG?3',扩增片段453 bp。

    1.2.7  RT?PCR检测    反应分两步进行,取总RNA 5 μg, 在AMV逆转录酶作用下逆转录为cDNA,以此为模板,分别按以下条件进行PCR反应,扩增KLF6:94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34个循环,最后72 ℃延伸10 min。扩增TGF?β1和α?SMA:94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34个循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR产物5 μl在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。凝胶电泳后,于Gel Doc2000凝胶图像分析系统进行扫描,用BandScan软件分析,测定产物条带的IOD,以β?actin为基准,做半定量分析,即以扩增目的片段β?actin的灰度值表示所扩增的目的基因片段的相对表达水平。

    1.3  统计学处理

    实验数据采用SPSS 10.0统计软件处理,组间差异采用单因素方差分析(one?way ANVOA);相关性分析采用Pearson Correlation方法;多元线性回归采用enter方法。P<0.05表示差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  病理学观察

    光镜下,对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞形态规则,胞质丰富,细胞核圆形(图1、2)。高脂喂养8周组,部分肝细胞内有脂肪滴沉积,细胞质疏松或肿胀,肝窦变窄,未见炎细胞浸润;12周组,肝细胞脂肪变加重并出现气球样变和汇管区少量炎细胞浸润,散在点状坏死,Masson染色可见少量胶原于窦周沉积增加;16周组肝细胞气球样变加剧,以腺泡3带明显,腺泡内点状坏死,门管区轻至中度炎症,Masson染色可见窦周、细胞周纤维组织增生;24周组,肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润较16周组有所减轻,但出现明显纤维组织增生。模型组大鼠均可见窦周纤维化,2例可见门管区星芒状纤维化,1例出现桥接纤维化(图3、4)。肝纤维化分级评分见表1。 表1  肝组织纤维化分级评分

    2.2  脂肪性肝纤维化形成过程中血清TG、FFA及肝功能指标的动态变化

    与对照组相比,模型组大鼠血清TG、FFA、AST、ALT等均较对照组显著增高,检测结果见表2。

    2.3  脂肪性肝纤维化形成过程中血清肝纤维化指标的动态变化

    随着脂肪性肝纤维化的进展,血清肝纤维化指标HA、LN和CⅣ水平呈逐渐增高趋势,其中HA于高脂12周明显增高(86.45±11.94,P<0.05),LN和CⅣ则分别于16周末开始增高,24周时HA、LN和CⅣ与对照组相比,差异均有统计学意义,检测结果见表3。表2  大鼠血清TG、FFA及肝功能指标的动态变化表3  大鼠血清肝纤维化指标的动态变化

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