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原发性肝癌患者外周血GPC-3 mRNA的表达与微转移的关系柏凯

来源:华世论文网
 
 【摘要】目的 探讨原发性肝细胞癌(HCC)患者外周血的Glypican-3(GPC-3)mRNA检测用于诊断HCC早期微转移的可行性。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测39例原发性肝细胞癌(HCC)、19例肝炎和肝硬化、10例转移性肝癌、10例肝血管瘤患者、19例健康献血员外周血GPC-3 mRNA水平。结果 HCC患者外周血中, GPC-3 mRNA的检出率为62%(24/39),GPC-3 mRNA 的检出率与肿瘤直径77%(17/22)、癌结节数目67%(19/24)、临床TNM分期76%(19/25)、门静脉癌栓90%(9/10)、远处转移100%(6/6)等临床参数密切相关。GPC-3 mRNA在转移性肝癌、肝炎和肝硬化、肝血管瘤患者及健康献血员外周血中均未检出。结论 巢式RT-PCR检测HCC患者外周血单核细胞GPC-3 mRNA是一种早期发现原发性肝细胞癌血道播散的可靠而又敏感的实验方法。

    【关键词】 肝细胞癌;GPC-3;巢式RT-PCR;微转移

  【Abstract】 ObjectiveTo explore the feasibility of Glypican-3 (GPC-3) mRNA as a marker of mi-crometastasis in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsSubjects GPC-3 mRNA in peripheral blood were detected by nested reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in 39 patients with HCC, 19 hepatitis B and liver cirrhosis, 10 the metastatic liver cancer, 10 hepatic hemangioma, and 19 healthy volunteers. ResultsGPC-3 mRNA was positive in the peripheral blood in 24patients with HCC (62%), and negative in patients with hepatitis and cirrhosis,hemangio-ma, metastatic liver cancer and healthy volunteers. The expression of GPC-3 mRNA was strongly corre-lated with tumor diameter, portal thrombosis, metastasia and TNM stage ( P <0.05). ConclusionsNested RT-PCR is a sensitive and reliable method for detecting circulating HCC cells.

    【Key words】HCC; GPC-3; nested RT-PCR; micro-metastasis

    早期微转移是原发性肝癌(HCC)难以有效诊治和病死率高的主要原因之一,因此早期检测出外周血中的肿瘤细胞,对及早有效的综合治疗具有重要的临床意义。血液微转移是HCC的主要转移途径[1],但血液微转移的诊断仍然存在困难,主要是没有找到能准确反映微转移的肿瘤分子标记物。近年来发现Glypican-3(GPC-3)与肝癌的发生发展有密切的关系[2]。本研究对HCC患者的外周血进行巢式RT-PCR检测,探讨GPC-3 mRNA检作者单位: 400037 重庆,第三军医大学新桥医院肝胆外科测对肝细胞癌微转移诊断的可行性。

    1 材料与方法

    1.1研究对象2004年3月至2005年12月,第三军医大学新桥医院及西南医院诊治的HCC患者39例、肝炎和肝硬化19例、转移性肝癌患者10例、肝血管瘤患者10例、健康献血员19例。各类患者的诊断均经组织病理学或影像学检查证实,实验操作同期进行。39例HCC患者中, 男性33例, 女性6例, 年龄30~72岁,平均(49±12)岁;其中TNM(国际抗癌联盟第6版TNM分期标准)Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分别为5例(13%)、9例(23%)、19例(39%)、6例(15%);伴门静脉癌栓10例(25%);伴肝外转移6例(16%);肿瘤直径≥5 cm者22例(55%);癌结节2个以上者24例(62%);分化程度高、中、低者分别为6例(32%)、7例(36%)、6例(32%);血清AFP≥31 μg/L者25例(69%)。肝外转移灶的诊断依据X线、CT或彩色超声检查。转移性肝癌的原发灶分别是直肠癌(4例)、结肠癌(3例)、胃癌(2例)和胆管癌(1例)。其中4例经过组织病理学检查证实,其余6例根据影像学及其血清学检查确诊。10例肝血管瘤诊断均经组织病理学证实。

    1.2 方法1.2.1标本采集采集受检者EDTA抗凝血5 ml。

    1.2.2单核细胞分离采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单核细胞。

    1.2.3细胞总RNA提取以Trizol采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取有核细胞总mRNA,经紫外分光光度计和变性胶电泳鉴定,证明制备RNA的纯度及未被降解。

    1.2.4cDNA合成3 μg RNA样本加入20 μl cDNA反应体系,参考美国Promega公司产品说明书进行cDNA合成。

    1.2.5PCR扩增GPC-3 mRNA时的一级PCR反应体系(50 μl):5μl cDNA模板、5 μl 10×缓冲液、4μl MgSO4 、4 μl dNTP、两条外引物各10 pmol、5 U Taq DNA聚合酶等。循环参数:94 ℃ 3 min→94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min,30个循环,68 ℃延伸7 min;取出5 μl反应产物,加入内引物,继续进行第二级PCR反应。反应体系同上,循环参数同上,共30个循环,最后72 ℃延伸10 min。扩增GPC-3外引物:上游引物:5'-AGACT-GCGGTGATGATGAAGAT-3',下游引物:5'-GAGAACGATAGAAAGGGAGGGA-3';GPC-3内引物:上游引物:5'-AACTCCGAAGGACAA-CGAGA-3',下游引物:5'-CTATGTTTGGCTGCT-AGAAC-3',产物全长402 bp。扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳30 min,通过凝胶成像分析仪观察并摄像。

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