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国产球囊导管制作大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型及特性的研究

来源:华世论文网
 

【摘要】  目的 探讨国产2.0 F球囊导管取代进口球囊导管致大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型的特点及可行性。方法 采用国产2.0 F球囊导管建立大鼠主动脉内皮剥脱模型,分别采用组织形态学和免疫组织化学方法,观察大鼠血管内皮剥脱后内膜增生情况及血管平滑肌细胞(VSMC)表型标志基因SM-肌动蛋白(SMα-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)及Ⅰ型胶原(collagenI)的表达活性。结果 采用国产球囊导管反复3次剥脱大鼠胸腹主动脉,与假手术组作比较,术后7 d模型组血管内膜增生不明显,SMα-actin及PCNA表达也均不明显;术后14 d内膜增生较明显,SMα-actin及PCNA表达均明显增强;术后21 d内膜呈进行性弥漫性增生,SMα-actin表达仍明显增高,但PCNA表达不明显。模型组7、14、21 d collagenⅠ表达与假手术组比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。结论 国产2.0 F球囊导管致大鼠主动脉损伤后,术后14~21 d出现明显的血管内膜增生引起血管再狭窄,其内膜增生主要是由于血管平滑肌细胞增殖所致。表明国产2.0 F球囊导管损伤血管后可取得与进口2F Fogarty球囊导管同样的效果。

【关键词】  球囊导管;血管平滑肌细胞;形态计量学;SM-肌动蛋白;增殖细胞核抗原;Ⅰ型胶原;大鼠

    〔Abstract〕 Objective To investigate the characteristics and feasibilities of intimal hyperplasia model induced by domestic-made 2.0 balloon catheter in place of imported balloon catheter in rats with aortal lesion. Methods The rat model of aortal endothelial denudation was established with domestic balloon catheter; and the intimal hyperplasia after vessel endothelial denudation and the active expression of SMα-actin, PCNA and CollagenⅠ were analyzed with immunohistochemistry and histomophorlogical methods respectively. Results Compared with sham operated group, the intimal hyperplasia in the group redenuded arterial endothelium by domestic balloon catheter was not obvious and the expressions of SMα-actin and PCNA were also not obvious after 7 days; then, hyperplasia began to be observed obviously, and the expression of both SMα-actin and PCNA were obvious very much after 14 days; and the diffuse hyperplasia was progressive but the expression of SMα-actin was still not obvious after 21 days.The difference of CollagenⅠexpression between model group and sham operated group was not statistic significance(P>0.05). Conclusions The vessel restenosis is caused after de-endothelialization from 14 to 21 days, in which the hyperplasia is mainly resulted by proliferation of vascular     经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)能明显减轻心血管疾病的症状,给患者带来福音。但术后的再狭窄(restenosis, RS)发生率仍然居高不下,影响了PTCA的远期疗效。球囊扩张后再狭窄的发生机制包括血管弹性回缩,损伤部位血栓形成,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖、迁移和细胞外基质积聚等[1],这些都是PTCA后再狭窄重要的病理生理学基础。目前,有关防治PTCA后再狭窄的发生发展是心血管疾病领域的热点问题。由于进口的球囊导管价格十分昂贵,且很难匹配应用于小动物模型,为建立可靠、价廉的方法,我们采用国产2.0 F球囊导管取代进口的球囊导管,建立大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型,并对该模型的特点及可行性进行了研究。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  健康雄性SD大鼠18只,体质量300~350 g,由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供,合格证号:医动字第20-010号;

    1.1.2  球囊导管  球囊由天津中拓乳胶科技发展有限公司提供;导管(51/2注射针改装)由河北医科大学基础医学研究所生物化学室温进坤教授、韩梅教授惠赠。国产2.0 F球囊导管由球囊和导管组装而成:将2 cm长的球囊套在导管一端,在导管出水孔的上下两个楔形槽分别用细丝线扎紧;导管另一端连接16号注射针并固定好。球囊导管准备好后,在尾端注入生理盐水充盈球囊(黄豆大小),回缩自如即可(见图1)。

    1.1.3  试剂  增殖细胞核抗原(The proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化染色试剂盒、兔抗大鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体、兔抗大鼠SMα-actin多克隆抗体、DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供, SP-9001免疫组化染色试剂盒、多聚赖氨酸由北京中杉金桥生物技术有限公司提供,其他试剂为进口或国产分析纯。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型的建立方法及分组  SD大鼠以水合氯醛麻醉后,作颈部正中切口,手术暴露及游离左颈总动脉1~1.5 cm,远心端结扎,在左颈总动脉近心端用动脉夹阻断后,于颈总动脉远心端剪一“V”形切口,插入国产2.0 F球囊导管,仔细操纵导管越过主动脉弓入胸,下至腹主动脉,深度约为6~7 cm。自导管尾端注入生理盐水0.4~0.6 mL充盈球囊,使球囊膨胀至回拉时有较明显的阻力感,保持阻力一致回拉导管至主动脉弓处,如此重复3次,旋转180°使球囊转至血管腔的另一面,依上法再重复3次,充分剥脱内皮。完成后撤出导管,结扎左颈总动脉近心端血管以止血,逐层缝合肌肉、皮下层及皮肤层。术后腹腔注射青霉素(PNC)20万单位消炎抗菌,连用3 d。将动物随机分为假手术组、模型7 d组、模型14 d组和模型21 d组。假手术组只进行手术操作,不插入球囊损伤。分别于术后不同时间点取损伤部位胸主动脉段进行形态学观察及SMα-actin、PCNA及collagenⅠ免疫组化检测。

    1.2.2  形态学及血管形态学计量指标的测定  大鼠麻醉后,放血处死,打开胸腔,在内皮剥脱段相同部位取血管1 cm,4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脱水,石蜡垂直定向包埋,每段血管间断均匀切片8~10张后,常规HE染色。每只大鼠标本不同时间点各随机取3片进行光镜观察、照相和图像分析。按组织学划分,内弹力膜以内为内膜,内弹力膜与外弹力膜之间为中膜。以MIAS医学图像分析系统分别测量外弹力膜内面积、内弹力膜内面积、管腔面积、外弹力膜周径、内弹力膜周径以及管腔周径。并在此基础上计算出中膜面积=(外弹力膜内面积-内弹力膜内面积)、内膜面积=(内弹力膜内面积-管腔面积)、中膜厚度=[(外弹力膜周径-内弹力膜周径)/2∏]、内膜厚度=[(内弹力膜周径-管腔周径)/2∏]、内膜面积增生比率=[内膜面积/(内膜面积+中膜面积)×100%]、内膜厚度增生比率=[内膜厚度/(内膜厚度+中膜厚度)×100%]、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比。

    1.2.3  免疫组织化学检测  分别对SMα-actin、 PCNA及collagenⅠ进行免疫组织化学染色,镜下观察相关抗原的表达变化,以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达信号。每个指标在假手术组、模型7 d组、模型14 d组和模型21 d组都设立一个阴性对照(阴性对照以PBS替代一抗)。用图像分析系统对表达信号进行分析。结果以灰度值表示,灰度值越小,表示相关的抗原表达越强。

    1.3  统计学分析

    应用SPSS11.5统计学软件进行分析,实验结果所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示,多组间均数比较用单因素方差分析,组间两两比较方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Dunnett’T3检验。

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